usg socha gdynia

Techniki wychwytu konformacji chromosomu (3C) mogą identyfikować związane z genem regulatory cis lub trans (25, 26). Metoda 3C została rozszerzona o ChIP, circularization i cloning (technika 6C). Celowo zastosowaliśmy podejście nie genomowe do zbadania krajobrazu regulacyjnego cis potencjalnego genu PTHLH. ChIP przeprowadzono na chromatynie linii komórek chondrocytów C28 / I2 z polimerazą II anty-RNA (rozpoznane fosforylowane S5) i przeciwciałami anty-H3K4me1 (27). Poszukiwaliśmy wzbogaconych w H3K4me1 CRE, które zostały połączone pętlami chromatyny z aktywnymi promotorami PTHLH lub SOX9, naszymi sekwencjami przynęt. SOX9, umiejscowiony na chromosomie 17 i wyrażany w C28 / I2, jest głównym czynnikiem transkrypcyjnym kierującym chondrogenezą w kończynie, znanym z regulacji cis dalekiego zasięgu (9, 28) i służył jako kontrola pozytywna. Wewnątrzcząsteczkowe podwiązanie przy ultra-wysokim rozcieńczeniu prowadziło do kolistej chromatyny (29). Używając odwrotnych orientacji oligos w przynętach, zamplifikowaliśmy PCR dowolnych CRE w okrągłej chromatynie, subklonowaliśmy zagnieżdżone amplikony PCR i zsekwencjonowaliśmy plazmidy (Figura 1B). Ograniczono klasyfikację odczytów: sekwencja przynęty musiała przylegać do CRE. Te specyficzne sekwencje w przybliżeniu 50 nt albo promotora albo promotora plus CRE były przeplatane przez kilka nt z powodu tępej końców naprawy końców chromatyny (Figura 1C). Losowo rozmieszczone pozycje na wszystkich chromosomach bez przynęt zostały sklasyfikowane jako niespecyficzne. Częstotliwość interakcji 2% SOX9 wskazuje zidentyfikowane 4 CRE na chromosomie 17, podczas gdy 16,2% pokazało 9 CRE dla PTHLH na chromosomie 12 (Figura 1D i Figura 2, A i B). Niespecyficzne sekwencje 92,6% w SOX9 6C w porównaniu z 47,9% w PTHLH 6C można wyjaśnić niższą ekspresją SOX9 obserwowaną (Figura 1E). Niespodziewanie wykryliśmy częstość interakcji 1,4% w SOX9 6C dla elementu trans na chromosomie 12 (Figura 1D). Ten sam pierwiastek wykryto również w PTHLH 6C (Figura 1C). Wyniki i walidacja 26C. (A i B) Częstotliwość interakcji danych SOX9 (A) i PTHLH (B) 6C. W SOX9 6C wykryto 4 CRE; 9 znaleziono w PTHLH 6C (czarne symbole). re70373, re18527 i re52431 były najbardziej obfite, a ponadto charakteryzowały się wysoką ochroną ssaków, wzbogaceniem H3K4me1 (ENCODE) i potencjałem regulacyjnym ESPERR (oznaczonym przez a + (3) (pozycje w bp; montaż UCSC hg18). re52431 wchodzi w interakcje z transem SOX9in. (C) Nowe biblioteki 6C zwalidowane przed wynikami 6C; kontrola była LCL. Bezpośrednie podejście PCR amplifikowało re70373, re18527 i re52431. W LCL interakcje C28 / I2 CRE były znacznie zmniejszone; tylko dla re70373 były interakcje w C28 / I2 i LCL wykryte jednakowo. (D) Odległości elementów cis i trans-regulatorowych zidentyfikowanych w PTHLH 6C i SOX9 6C. re18527 (18 527,200 bp) i re52431 (52 413 500 bp) oddziaływały z PTHLH, re70373 (70 373 400 bp) oddziaływano w cis i re52431 w trans z SOX9. re52431 został dodatkowo nazwany CISTR-ACT, ze względu na jego interakcje cis i trans. (E) Testy reporterowe lucyferazy re70373, CISTR-ACTF (pełnej długości sekwencja regulatorowa) i CISTR-ACTS (zawierające najbardziej konserwatywne części) zostały umieszczone przed promotorem SOX9; wszystkie 3 ulepszone transkrypcje. (F) re18527, CISTR-ACTF i CISTR-ACTS, same lub w kombinacji, kontrolowały promotor PTHLH i zwiększoną transkrypcję lucyferazy (n = 6). *** P. 0,001; ** P. 0,01; * P. 0,05. Następnie wykorzystano ChIP do ilościowego oznaczenia wzbogacenia zidentyfikowanych CRE według 6C w H3K4me1 i H3K4me2 przez ilościową PCR (qPCR, Suplementowa Figura 2 i odn. 30). Aby sprawdzić właściwości regulacyjne przypuszczalnych zidentyfikowanych przez C-6 CRE, przeanalizowaliśmy międzygatunkowe zachowania PhastCons, wzbogacanie ENCODE H3K4me1 i potencjał regulacyjny ESPERR w UCSC
[podobne: kłykciny kończyste leczenie, evra ulotka, kalprotektyna ]