izotiocyjanian fluoresceiny

Komórki CLL również analizowano pod kątem CD19, CD20 i CD23 z użyciem przeciwciał monoklonalnych skoniugowanych z kompleksem allofikocyjaniny, perydyniny-chlorofilu-A i izotiocyjanianu fluoresceiny, odpowiednio (Pharmingen), jak opisano wcześniej2. Izotyp sprzężony z fluorochromem kontrolne przeciwciała monoklonalne o nieistotnej swoistości zastosowano we wszystkich doświadczeniach do monitorowania niespecyficznego wybarwiania. Analiza sekwencji ekspresji IgVH
Izolowaliśmy RNA z komórek CLL za pomocą RNeasy (Qiagen). Komplementarny DNA pierwszej nici (cDNA) został zsyntetyzowany z całkowitego RNA za pomocą starterów oligo-dT i SuperScript II (Life Technologies). Pozostałe RNA usunięto za pomocą RNazy H, a cDNA oczyszczono za pomocą kolumn QIAquick oczyszczających (Qiagen). Oczyszczony cDNA zawierał poli-dG-tailed z trifosforanem deoksyguanozyny i końcową deoksytransferazą (Roche). Podgrupę IgVH eksprymowaną przez limfocyty B z CLL określono za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (PCR) i testu immunoenzymatycznego.24. CDNA zamplifikowano metodą PCR z użyciem mieszaniny oligonukleotydu nici sensownej. primery specyficzne dla sekwencji liderowej eksprymowanego startera antysensownego oligonukleotydu swoistego dla regionu stałego łańcucha ciężkiego .. Produkty PCR wybrano pod względem wielkości za pomocą elektroforezy w 2% agarozie o niskiej temperaturze topnienia. Produkty następnie wycięto i oczyszczono (MinElute PCR Purification Kit, Qiagen). Wcześniejszy oligonukleotyd C. zastosowano do primingu cDNA do syntezy końca łańcucha dideoksy fluorescencji.
Fragmenty cDNA oceniono za pomocą automatycznego analizatora sekwencji kwasu nukleinowego (377, Applied Biosystems). Sekwencje nukleotydów analizowano przy użyciu oprogramowania DNASTAR i porównywano z sekwencjami w bazach V Base i GenBank. Procent homologii do najbliższej sekwencji IgVH linii zarodkowej obliczono na podstawie liczby różnic nukleotydowych między końcem 5 zrębu i końcem 3 zrębu 3. Sekwencje z mniejszą niż 98 procentową homologią z odpowiadającą IgVH linii zarodkowej sekwencja była uważana za zmutowaną.
Analiza statystyczna
Związki pomiędzy stanem mutacji ZAP-70 a IgVH oceniano za pomocą dokładnego testu Fishera dla danych binarnych, testu Kruskala-Wallisa dla uporządkowanych danych kategorycznych i testu sumy rang Wilcoxona dla danych ciągłych. Ekspresję ZAP-70 uważano zarówno za zmienną ciągłą, jak i uporządkowaną zmienną kategoryczną w oparciu o następujące grupy: 0 do 10 procent, więcej niż 10 procent, ale nie więcej niż 20 procent, więcej niż 20 procent, ale nie więcej niż 30 procent, i więcej niż 30 procent. Czas od rozpoznania CLL do początkowego leczenia oceniano metodą Kaplana i Meiera i oceniano za pomocą testu log-rank. Dane od pacjentów, którzy nie zostali jeszcze poddani leczeniu z powodu choroby, zostały uznane za ocenzurowane. Powiązanie statusu mutacji IgVH, ekspresji ZAP-70 i czasu od diagnozy do rozpoczęcia terapii badano za pomocą modelu proporcjonalnych hazardów Coxa. Wszystkie wartości P są dwustronne i nie ma korekty dla wielokrotnych porównań.
Wyniki
Wykrywanie ZAP-70 za pomocą cytometrii przepływowej i analizy immunoblotów
Rysunek 1
[więcej w: oponiak mózgu, śluz z odbytu, torbiel pilonidalna ]
[podobne: krążek międzykręgowy, kregozmyk, krioglobulinemia ]